哺乳动物胚胎发育是一个紧密调控、有序的过程，在小鼠胚胎发育到二细胞（2C）时期，合子基因组开始大量转录激活，并伴随着內源性病毒（Endogenous Retro Virus, ERV）的瞬时上调。此时的细胞被认为是具有全能性的细胞，具有形成胚胎的和胚胎外部组织的能力。胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell, ESC）来自于胚胎早期发育至囊胚期的内细胞团，能够分化成为三个胚层以及生殖细胞，因此是具有多能性的细胞。近年来研究发现，在体外培养的ESCs中，有一小部分细胞能够自发转变成二细胞样（2C-like）细胞。ES-2C转变如何被调控是该领域内备受关注的问题。现已有文章报道表观遗传因子、miRNA、LINE1等参与2C基因和ERV的表达调控，但ES-2C转变的稳态调控与维持的分子机制仍需要进一步探究。

2021年7月31日，浙江大学基础医学院干细胞与再生医学中心/浙江大学医学院附属第一医院/浙江省良渚实验室的张进课题组在Protein & Cell杂志上发表题为“LIN28 Coordinately Promotes Nucleolar/Ribosomal Functions and Represses the 2C-like Transcriptional Program in Pluripotent Stem Cells”的研究论文，本研究首次报道RNA结合蛋白LIN28在ES-2C转变调控中的作用以及分子机制。

LIN28是一种RNA结合蛋白，在小鼠胚胎早期发育、干细胞分化/重编程、肿瘤发生和代谢中具有重要作用。以往的研究主要集中于它在细胞质中与Let-7 microRNA前体或mRNA的相互作用，而LIN28在细胞核中的作用尚不十分清楚。本研究发现LIN28在小鼠早期胚胎发育过程中在时间和空间上呈现动态变化。在胚胎二细胞时期，母源性LIN28逐步被降解，从四细胞开始，合子的LIN28开始表达且定位在核仁前体的外周。随着核仁的逐渐成熟，LIN28的定位也转移到核仁中。在体外培养的ESCs中，LIN28的缺失能够上调2C/4C特异性表达的基因和ERV的表达。同时，LIN28的敲除导致ESCs中2C-like细胞比例的上调和细胞增殖能力的降低（图1）。

图1. LIN28的缺失上调2C/ERV基因的表达，降低细胞增殖能力。

进一步研究发现，参与调控2C/ERV基因的上游转录因子DUX，在LIN28敲除的细胞中表达显著上调。并且Dux的敲低能够恢复Lin28缺失引起的2C/ERV表达的上调。ChIP-seq的结果显示，LIN28敲除导致Dux及其下游靶基因的H3K9me3表观遗传修饰水平显著下调，说明LIN28通过调控DUX的表观遗传修饰来参与2C/ERV表达的调控（图2）。

图2. LIN28通过抑制Dux调控ERV的表达。

在分子机制方面，本研究发现，一方面，LIN28能够与核仁内的RNA，包括snoRNA和rRNA相互作用，从而维持核仁的完整性，LIN28的缺失会导致rRNA表达水平下调、核仁相分离缺陷、翻译功能的减弱，引起核仁应激和p53的激活。而激活的p53蛋白能够与Dux DNA结合促进其表达，进而激活2C基因和ERV的表达。这一结果与Edward J. Grow等人近期发表的文章的结果一致（图3）。

图3. LIN28与snoRNA和rRNA结合，其缺失导致rRNA生成减少和核仁应激。

另一方面，LIN28能够与核仁蛋白Nucleolin（NCL）和转录抑制因子TRIM28相互作用，LIN28敲除导致NCL/TRIM28复合体在Dux DNA和rDNA上的结合减少（图4），进而导致Dux基因表达抑制作用被解除、rRNA转录被抑制。因此，LIN28缺失导致ESCs呈现细胞周期变慢、翻译和代谢水平下调的2C-like状态。提示与此前报道的LINE1机制类似， LIN28可能协调参与了关闭2C program，并开启4C后的核仁生成的program。

图4. LIN28A与NCL/TRIM28复合物相互作用可以同时介导对rDNA和2C基因表达的调控。

为了进一步验证核仁与ES/2C-like状态转变的关系，通过比较tomato标记的2C-like阳性细胞与阴性细胞的转录组数据，作者发现阳性细胞群核糖体基因的表达水平和细胞周期都显著低于阴性细胞群。单细胞转录组测序数据也发现，在野生型的ESCs中，ERV的表达与核糖体基因的表达呈现显著的负相关（图5）。

图5. ERV基因表达与核糖体蛋白基因呈较强的负相关。

同时，胚胎实验结果也证实了上述结论，虽然LIN28缺失的胚胎可以发育到囊胚，LIN28的敲低可以导致囊胚期蛋白翻译水平的下调、2C基因和ERV表达的上调以及核糖体基因表达的下调（图6）。

图6. 在早期胚胎发育过程中，LIN28抑制2C基因的表达和促进核糖体基因的表达。

总之，本研究首次揭示了定位于核仁中RNA结合蛋白LIN28在小鼠早期胚胎发育过程中的新功能，以及LIN28介导的核仁完整性在ES-2C状态转变和基因表达调控中的作用。

图：LIN28调控核仁功能以及2C-ES状态转变的示意图

该论文的共同第一作者是浙江大学基础医学院的科研助理孙振、博士后余华和博士生赵静，还得到了清华大学沈晓骅课题组，浙江大学沈力、冯钰、孙启明、陈铭课题组等国内外单位与课题组的支持。