肠神经系统（enteric nervous system; ENS）是神经元胞体位于肠内的神经系统，可独立于大脑发挥作用，被称为人体“第二大脑”，即“肠脑”。人体ENS由约5亿个神经元组成，这些神经元与肠内免疫细胞、内分泌细胞、血管及平滑肌相互作用以维持肠道功能。同时，ENS也通过周围神经（内脏感觉、交感和副交感神经）同大脑联系，形成脑-肠轴双向神经传导通路。最近研究发现ENS与肠内菌群互动参与帕金森氏病、自闭症和抑郁症等精神疾病发生与发展。确定ENS胚胎学来源并揭示其发育调控机制有助于了解ENS功能并为ENS相关肠道和精神疾病的机制研究提供理论支持。

  ENS来源于神经嵴细胞（neural crest cells; NCCs）。NCCs为一群产生于神经管背侧多潜能细胞，依据其形成神经管位置分为四个亚群，每一亚群可迁移至身体不同位置形成不同类型细胞（图 1）。现今领域内对于ENS胚胎学来源的共识是：迷走神经嵴细胞（vNCCs）进入食管后沿肠道由近侧端向远侧端迁移形成绝大部分ENS，骶神经嵴细胞（sNCCs）自骶部神经管迁移进入末端结肠后由远侧端向近侧端迁移对结肠ENS有所贡献（图1）。先天性巨结肠（Hirschsprung’s disease; HD）是一种临床常见新生儿疾病，发病率为1/2000～1/5000，病理特点为vNCCs沿肠道迁移障碍导致的远端肠道神经节细胞缺失（图1）。sNCCs对ENS贡献理论无法解释HD病理特点，因而对人们理解HD发病机制造成极大困扰。同时，斑马鱼的研究结果揭示sNCCs对ENS没有贡献，人体sNCCs对ENS贡献的证据也是缺乏。因此，提供可信实验证据以确定sNCCs对ENS贡献与否极为必要。

图1 课题背景：左图修改自Nature Reviews Neuroscience 2007,8:466-479，中图和右图由王良课题组提供 

2024年3月5日，浙江大学基础医学院人体解剖和组织胚胎学系、浙江大学医学院附属第二医院神经内科、双脑中心王良课题组联合德国亚琛工业大学医学院Till Marquardt课题组，在消化领域国际重要期刊Gastroenterology上发表了题为“Sacral neural crest-independent origin of the enteric nervous system in mouse”的最新研究成果。该项研究通过构建基因编辑小鼠对vNCCs和sNCCs进行谱系追踪，结合三维重建和体外共培养等研究方法，揭示sNCCs对ENS没有贡献。研究成果理清了关于ENS胚胎学来源的争议，为理解ENS发育机制及ENS相关疾病发病机制奠定了一定理论基础。

sNCCs对ENS有所贡献的实验证据来自三方面：

1）通过在早期鸡和小鼠胚胎的神经管内注射示踪剂标记sNCCs后，在经过体外培养的胚胎的肠道内发现了标记细胞。但是该实验方法存在特异性差的缺陷，即示踪剂可能同时标记神经管内外的非sNCCs细胞；2）利用NCC标记物进行免疫染色发现结肠内存在非vNCCs细胞。同样该实验方法无法证明这些细胞来自骶神经管；3）通过鸡-鹌鹑神经管移植实验或者小鼠盆腔神经节结肠共培养实验发现肠道内存在sNCCs。由于这些实验操作改变了sNCCs正常的体内迁移环境，因此极有可能改变了sNCCs迁移特性。为了弥补上述实验方法缺陷，研究人员首先利用sNCCs的迁移特点及Wnt1基因的表达特点，构建Wnt1^DreERT2；H11^RSRYFP小鼠对sNCCs进行谱系追踪发现sNCCs没有迁移进入肠道，得出sNCCs对ENS没有贡献的初步结论。随后，科研人员构建了针对vNCCs的Sox10^CreERT2；Phox2b^FLP；Ai65谱系追踪小鼠，并将此小鼠同Wnt1^DreERT2；H11^RSRYFP小鼠交配进一步构建Wnt1^DreERT2；Phox2b^FLP；Sox10^CreERT2；H11^RSRYFP；Ai65，即WPS小鼠。WPS孕鼠接受Tamoxifen注射后，胚胎体内sNCCs通过Dre-Rox基因重组被YFP标记，vNCCs通过FLP-FRT和Cre-loxp基因双重组被TOM标记，进而实现对sNCCs和vNCCs同时标记。WPS小鼠谱系追踪结果表明，sNCCs没有迁移进入肠道，vNCCs为ENS唯一胚胎学来源（图2）。

图2 sNCCs对ENS没有贡献

综上，该项研究成果通过修正ENS发育模式（图3），理清半个多世纪来关于ENS胚胎学来源的争议，在完善ENS发育理论同时也为理解先天性巨结肠发病机制提供了新的洞见。同时，由于一些课题组已经开始探索以sNCCs为靶细胞的先天性巨结肠治疗策略，研究成果将有助于锁定vNCCs为ENS发育缺陷疾病的治疗靶标细胞，因而对ENS发育缺陷疾病的治疗具有一定指导作用。

图3 肠神经胚胎学来源发育模式修正图

王良课题组余琦博士（现为浙江大学基础医学院、浙江大学医学院附属第二医院博士后）、刘莉博士（现为浙江大学医学院附属儿童医院博士后）、杜梦洁博士（现为浙江大学医学院附属第二医院病理科主管技师）为本文共同第一作者。浙江大学基础医学院王良长聘副教授主导了这项研究，为论文最后通讯作者。德国亚琛工业大学医学院Till Marquardt教授为论文共同通讯作者。本研究获得国家自然科学基金面上项目和浙江省自然科学基金重点项目资助。王良课题组博士生辛晓龙和顾艳兰及Till Marquardt课题组Daniel Muller博士参与课题并作出一定贡献。该项工作获得浙江大学基础医学院谷岩教授、浙江大学医学院附属儿童医院高志刚主任医师及复旦大学脑科学研究院何苗研究员的大力支持。课题组感谢浙江大学医学院公共技术平台方三华老师提供的技术支持及上海南方模式生物有限公司协助制备基因编辑小鼠。

王良，浙江大学长聘副教授，博士生导师，浙江大学基础医学院和浙江大学附属第二医院双聘教授，系统医学中心和双脑中心独立研究员。课题组研究方向为周围神经，重点关注内脏神经（内脏感觉、交感和副交感神经）、肠神经和内脏施旺细胞的发育机制及相关疾病发病机制，长期目标为周围神经疾病的临床治疗提供相关的理论指导。近年来作为最后通讯作者在Gastroenterology、CMGH和Journal of Neuroscience杂志上发表多篇论文。王良课题组长期欢迎研究生报考和博士后应聘，欢迎有医学和生物学背景且对周围神经发育具有浓厚兴趣的人员联系咨询，有意向可发送简历至lwang1@zju.edu.cn。