基因激活技术是研究基因功能的重要工具，在生命科学和医学领域具有广泛的应用前景。一个很有意思的科学问题是特定启动子启动基因表达的强度存在多大的动态范围。基因转录调控机制是最大化人工操纵基因表达的重要理论基础。转录因子（transcription factor, TF）是一类能够以序列特定方式结合DNA从而确保目的基因在特定的时空下、以特定的强度进行表达的蛋白质分子。超级增强子是由增强子成簇形成，能够富集极高密度的转录因子和其他共激活因子（coactivator），从而调控决定细胞命运和功能的关键基因。CRISPRa技术通过dCas9招募转录激活因子到目标基因的转录起始位点附近进行转录激活。研究人员可通过使用单个sgRNA激活靶基因，使全基因组的CRISPRa转录激活筛选成为可能。然而，联用多个sgRNA可以显著提高CRISPRa的激活效率。因此，如何招募尽可能多的转录因子到转录中心处是开发新一代基因激活工具的一个突破口。
2022年11月28日，《Nature Communications》在线刊登了浙江大学基础医学院/附属第一医院陈宝惠研究员-转化医学研究院/附属第四医院邹炜研究员联合团队的学术论文“Gene activation guided by nascent RNA-bound transcription factors”。
该研究开发了Narta（nascent RNA-guided transcriptional activation）技术，通过目标基因的新生RNA将大量人工转录激活因子招募到转录位点，从而实现外源及内源基因启动子的高效激活。Narta介导的基因激活是可逆、可调节和特异的。与CRISPRa相比，Narta对部分基因表达的激活强度更高；与CRISPRa联合使用时，可进一步提升某些靶基因的转录水平。单细胞荧光成像结果表明Narta激活过程中可富集p300、MED1和BRD4等共激活因子，部分解释了Narta高水平激活基因表达的分子机制。
CRISPRa的原理是通过dCas9/sgRNA 复合物将有限的转录因子招募到转录起始位点附近。与CRISPRa的工作原理不同，Narta技术是通过构建NarTag荧光蛋白标签（陈宝惠团队2020年开发的TriTag可直接作为NarTag使用），该标签的人工内含子中包含了特殊的DNA序列（例如MS2）。和NarTag融合表达的目标基因转录产生的新生RNA可结合人工合成的转录激活因子，例如stdMCP-p65-HSF1（简称stdMCP-PH），理论上能将大量转录激活因子聚集到转录中心处，从而实现基因转录的高水平激活。该工作通过单细胞目标基因转录水平的实时成像，直观地观察到Narta激活促进了更多的新生RNA产生。荧光定量PCR和单细胞smFISH分析显示Narta激活后细胞产生了更多的成熟RNA。单细胞蛋白定量成像和Western Blotting显示目标基因的蛋白表达水平有了非常显著的提高。Narta技术在HeLa、 HEK293T和CHO-K1等细胞系及斑马鱼中均能实现基因激活。
另外，Narta技术能增强不同强度的外源启动子表达，包括miniCMV、SFFV、CMV和CAG等，在人类细胞内测试的14个内源基因均表现出不同程度的激活。
图1 Narta的测试体系和潜在的转录激活原理
通过与激活效率较高且运用较为广泛的CRISPRa系统（dCas9-VPR和dCas9-SunTag-10XPH, 简称VPR和SPH）相比，Narta对大多数靶基因的转录激活强度都优于CRISPRa。两种激活技术联合使用，能使一些基因的激活进一步增强。
该工作还对影响Narta激活效率的因素以及激活原理进行了初步解析，为将来进一步优化和开发Narta技术奠定了基础。目前Narta技术最主要的局限是需要对目标基因进行荧光蛋白标签NarTag插入的基因编辑，将来利用CRISPR/Cas13系统有望实现直接利用新生RNA天然内含子序列来招募转录因子，从而实现Narta技术的升级。
图2 Narta与CRISPRa的对比和联用
利用荧光蛋白对内源蛋白进行可视化成像是基础研究的重要工具。然而基因编辑效率、阳性细胞的流式分选效率以及内源蛋白的本底表达水平都可能限制该方法的运用。值得注意的是NarTag本身是个荧光蛋白标签，且其标记目标基因并没有明显改变基因的表达水平。该研究表明Narta的瞬时激活能显著提高CRISPR敲入荧光蛋白的阳性细胞分选效率。若目标蛋白表达水平很低，不利于活细胞长时间成像或超分辨成像，研究人员可借助Narta技术对这类基因进行适当水平的转录激活。因此，该工作还展现了Narta技术在荧光检测与成像中的潜在运用。
增强子和超级增强子可转录产生称为增强子RNA(eRNA)的转录产物。eRNA可将转录因子招募到邻近蛋白质编码基因的启动子上从而调节转录水平。Narta系统中的新生RNA可能扮演了与eRNA类似的角色。越来越多的证据表明，编码蛋白质的mRNA可以执行额外的非编码功能。该工作表明新生RNA内含子序列作为一个通用的结合平台来招募人工转录因子是实现基因调控的有效方法。Narta技术的建立为未来开发基因激活方法提供了一个新思路。cDNA过表达、CRISPRa和Narta三种方法为研究人员提供了满足不同需求的基因过表达的多样化选择。
浙江大学基础医学院博士生梁鹰和徐海月为本文的共同第一作者。研究生扶玉娟、王君岩，博士后钱文畅博士、程涛博士和周悦南博士，本科生黄晗薇也参与了本研究。浙江大学基础医学院陈宝惠研究员和转化医学研究院邹炜研究员为本文的通讯作者。本研究得到了徐鹏飞研究员、钱鹏旭研究员和尹亚飞研究员等的大力支持和帮助。本项目获得了国家科技部重点研发计划和国家自然科学基金的资助。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-35041-7