肿瘤细胞及其驱动因素的异质性在肿瘤发生进展中起着重要作用，并对肿瘤治疗有重要影响。单细胞RNA测序（scRNA-seq）能够在单细胞水平上测量转录信息，从而准确地解决肿瘤细胞异质性。但是，scRNA-seq在处理临床肿瘤样本，尤其是标本组织（例如冷冻组织）时，仍然面临着许多的后勤和技术挑战。首先，临床肿瘤样本的scRNA-seq需要采取快速组织解离措施，目前大多数医院的常规病理实验室不具备相关条件。其次，大多数scRNA-seq方法使用oligo-dT引物来捕获polyA尾RNA，对组织样品的质量要求较高，且会丢失非polyA尾RNA信息。第三，高通量scRNA-seq方法只能检测转录本的3'或5'端片段，这限制了临床样本的突变和剪接分析。

2023年11月27日，浙江大学基础医学院郭国骥课题组、良渚实验室王永成课题组、浙江大学基础医学院韩晓平课题组、浙江大学附属第一医院梁廷波课题组、良渚实验室王晶晶课题组和浙江省肿瘤医院王长春课题组合作在Advanced Science上发表了题为Pan-Cancer Single-Nucleus Total RNA Sequencing Using snHH-Seq的研究论文，报道了一种高通量、高灵敏度的单细胞核总RNA测序方法snHH-seq，并使用该方法绘制了囊括9种肿瘤，70余万单细胞的泛肿瘤单细胞图谱，全面解析肿瘤转录组数据，包括表达水平、突变、剪接模式、克隆动态等。

首先研究人员将随机引物和预索引策略结合在液滴微流控平台上，开发了高通量高灵敏度单核总RNA测序方法，snHH-seq。使用细胞核进行单细胞测序，解除了对非新鲜样本分析的限制，降低了细胞解离的难度，并减少解离过程中产生的应激反应，使得样本的多时间维度分析成为可能。使用随机引物而不是oligo-dT引物捕获RNA，不仅可以拯救部分降解的样本，而且具有更高的灵敏度（一个转录本有多个引物结合位点）和更高的覆盖率（转录本的3'和5'端，polyA尾RNA和非polyA尾RNA）。预索引策略应用于基于微流控液滴和微孔板的单细胞测序平台，能够提高至少一个数量级的细胞通量，并实现样品的并行分析。同时研究人员也为全长单细胞测序提供了详细的分析流程，用于更好地解析snHH-seq数据。

图1 snHH-seq实验分析流程

基于snHH-seq所展现的高通量和高灵敏度，研究人员分析了32例临床冷冻肿瘤样本，涵盖了中国发病率和死亡率最高的肿瘤类型，包括肺腺癌（LUAD）、肝细胞癌（HCC）、肝内胆管癌（ICC）、胶质瘤、结肠腺癌（COAD）、直肠腺癌（READ）、乳腺浸润性癌（BRCA）、食管癌（ESCA）和胃腺癌（STAD）。通过数据的整合，研究人员绘制了泛肿瘤单细胞图谱（>70万单细胞核）。通过对泛肿瘤图谱的全面解析、（包括表达水平、突变、剪接和克隆动态等），研究人员识别了新的恶性细胞亚群并探索它们在癌症中的特定功能；探究突变对RNA剪切的影响；从拷贝数变异和体细胞突变等多维度描绘肿瘤转移过程。

图2 泛肿瘤图谱的构建及分析

综上，该研究建立了一种高通量和高灵敏度的单细胞核测序平台snHH-seq，并且证明了高分辨率单细胞核全长转录组测序对于识别新型肿瘤生物标志物的价值。这些发现加深了我们对肿瘤生物学的理解，并为更有效的诊断和治疗方法铺平了道路。

浙江大学基础医学院郭国骥教授、良渚实验室王永成教授、浙江大学基础医学院韩晓平教授、浙江大学附属第一医院梁廷波教授、良渚实验室王晶晶研究员和浙江省肿瘤医院王长春副主任医师为本文的通讯作者。良渚实验室陈海德、香港大学方秀南博士、良渚实验室邵纪凯、浙江大学附属第一医院章琦副教授、浙江省肿瘤医院徐丽伟博士、M20 Genomics生信研发工程师陈嘉业为本文共同第一作者。研究获得了国家重点研发计划、国家自然科学基金的支持。