线粒体是细胞中含量丰富的双层膜细胞器，是细胞的能量代谢中心，其功能缺陷会直接影响细胞及生命体的健康。其中，线粒体膜蛋白的功能缺陷会直接影响线粒体活性，细胞能量代谢，轻则严重影响生物体的发育及健康，重则直接导致其死亡。fzo-1/Mfn2是一种线粒体外膜蛋白，其主要功能是介导线粒体外膜的融合，其突变会导致线粒体持续片段化，严重影响线粒体功能。在小鼠中，Mfn2突变会造成胚胎死亡，而在线虫中，该突变体的发育比野生型线虫慢，但其可以存活并长大。线虫线粒体可能存在新的机制来维持片段化线粒体的活性及基本的能量代谢。
2023年6月12日，浙江大学基础医学院徐素宏团队在EMBO Reports期刊上发表了 “MIRO-1 interacts with VDAC-1 to regulate mitochondrial membrane potential in C. elegans”的研究论文，发现线粒体外膜蛋白MIRO-1与VDAC-1互作对维持线粒体膜电势稳态及ATP合成至关重要。在fzo-1突变诱导的持续片段化线粒体上，MIRO-1表达量上升并增强与VDAC-1互作从而选择性的维持部分线粒体的膜电势，从而维持fzo-1线虫基本的线粒体活性和后代数目。
线粒体作为细胞中能量代谢的中心细胞器，其不仅负责ATP合成，同时参与调控细胞凋亡、自噬及钙离子稳态等重要生物学过程。因此，维持线粒体的数量及质量对细胞的生存至关重要。线粒体膜电势（ΔΨm）是衡量线粒体健康与否的重要指标之一。在氧化磷酸化过程中，电子传递链复合物（I；III；IV）会向膜间腔泵出质子，从而在线粒体内膜上形成电势差，即线粒体膜电势，进而驱动复合物V（ATP合酶）将ADP转化成ATP。fzo-1/Mfn2是负责线粒体外膜融合的蛋白，其突变会直接导致线粒体持续片段化及膜电势的急剧降低，进而影响ATP合成及细胞正常生理功能。人源Mfn2突变会导致腓骨肌萎缩症（Charcot-Marie-Tooth，CMT）,也称为遗传性运动和感觉神经病（hereditary motor and sensory neuropathy, HMSN），是临床最常见的遗传性周围神经病。在小鼠中，Mfn2突变造成胚胎死亡。而线虫fzo-1突变并不会导致后代全部死亡，其可以一直存活并长大。那fzo-1突变的线虫是否有其它补偿机制在调控线粒体活性以保持其生长发育及后代生产。
研究团队意外发现，在fzo-1突变体表皮细胞中，有一部分片段化线粒体外膜上聚集了大量的MIRO-1蛋白，而这些聚集有MIRO-1蛋白的线粒体具有较高的线粒体膜电势，而膜电势较低的线粒体上MIRO-1信号较弱（图1）。同时，在人为损伤诱导的片段化线粒体中也观察到了类似现象。因此，研究团队推测MIRO-1在片段化线粒体外膜大量聚集可能是为了维持这些线粒体的膜电势。与此同时，fzo-1;miro-1双突变体较fzo-1单突变体线虫活力及后代数目显著降低，表明fzo-1线虫可能通过MIRO-1维持线粒体活性，从而提高其生存质量。
图 1 fzo-1突变体中，MIRO-1聚集在膜电势较高的线粒体外膜
为了探索MIRO-1对线粒体膜电势的调控作用，研究团队直接利用miro-1突变体线虫进行膜电势检测。结果显示，相较于野生型线虫，miro-1突变体表皮线粒体膜电势明显下降，而过表达MIRO-1则明显升高线粒体膜电势。与此同时，研究团队还通过直接分离线虫线粒体进一步确认了来自于miro-1突变体的线粒体较野生型具有更低的膜电势。
由于MIRO-1介导线粒体在微管上的运输，其本身并非是通道蛋白，不直接参与线粒体呼吸链及膜电势的形成，那么MIRO-1如何调控线粒体膜电势。研究团队进一步利用蛋白互作邻近标记系统，利用液相质谱联用技术对MIRO-1的潜在互作蛋白进行鉴定，发现线粒体外膜通道蛋白VDAC-1可能是MIRO-1的互作蛋白，并通过体内外蛋白质免疫共沉淀实验验证MIRO-1与VDAC-1具有相互作用。
在此基础上，研究团队利用Alphafold2对MIRO-1及VDAC-1的互作位点进行预测并验证了MIRO-1的473位谷氨酸与VDAC-1的163位赖氨酸是其可能的互作位点。通过进一步构建MIRO-1第 473位谷氨酸内源性点突变的线虫，发现该突变体的线粒体膜电势相较于野生型亦显著性下降，说明阻断MIRO-1与VDAC-1互作会显著改变膜电势稳态。与此同时，MIRO-1与VDAC-1的互作在fzo-1突变体中明显增强，说明fzo-1突变体中高表达的MIRO-1更多的与VDAC-1相互作用，从而维持这些片段化线粒体的膜电势。
这项工作提出了一种新的线粒体膜电势调控机制：MIRO-1通过与VDAC-1相互作用来调控线粒体膜电势，阻断它们的互作会直接影响膜电势的稳态。在部分片段化的线粒体上，MIRO-1高表达并增强与VDAC-1的互作维持其膜电势稳态。该研究利用线虫系统，通过遗传学、快速和高分辨活体显微成像、基因编辑、体内外蛋白互作及质谱分析等技术，在活体动物体内尝试解析线粒体膜电势的内源性调控机制，首次发现了线粒体外膜蛋白MIRO-1可以通过与通道蛋白VDAC-1互作调控膜电势稳态。这一现象与MIRO-1泛素化降解参与调控线粒体自噬起始过程中膜电势下降不谋而合，为今后通过遗传学筛选参与调控线粒体膜电势的新机制奠定了基础。
图2 MIRO-1维持线粒体膜电势稳态机制
该项工作与浙江大学杨帆、杨兵、Mikael Bjorklund等多位教授一起合作完成。项目研究过程中受到了刘伟、孙启明、周以侹等教授的帮助。徐素宏为本文的通讯作者，浙江大学医学院博士后任学聪和浙大爱丁堡大学联合学院（ZJE）周恒达博士为本文共同第一作者。该项目受到国家自然科学基金委、科技部重点研发计划、浙江省自然科学基金及博士后科学基金等经费的支持。
原文链接： https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embr.202256297