疱疹病毒（herpesviruses）是一类在人和动物宿主中广泛存在的DNA病毒，其中单纯疱疹病毒I型（HSV-1）普遍感染人类，据估计，全球有37亿人（67%）是HSV-1携带者。多数HSV-1感染宿主细胞后长期处于潜伏状态，但是机体受到各种压力刺激或免疫力低下时，病毒会活跃增殖并使人体呈现症状，包括引起疼痛的水泡或溃疡，导致多种疾病，如口唇疱疹、疱疹病毒性角膜炎和脑炎等。目前有药物可缓解疱疹症状，但并不能治愈感染。病毒感染是一个与宿主细胞内各种亚细胞结构相互作用的动态过程。入侵病毒如何利用宿主细胞内的资源，如何选择或拮抗细胞通路，从而实现其自身复制与增殖，在分子水平上仍然知之甚少。在活细胞中追踪单个病毒的成像方法提供了实时监测病毒侵染与复制的重要研究工具，有助于解析病毒入侵宿主的分子机制，促进预防和治疗策略的开发。
2022年12月1日，《Journal of Virology》在线刊登了浙江大学基础医学院/附属第一医院陈宝惠研究员-转化医学研究院/附属第四医院邹炜研究员联合团队与基础医学院病原生物学与微生物学系潘冬立教授合作的学术论文“Two-color CRISPR imaging reveals dynamics of HSV-1 replication compartments and virus-host interactions”。该研究建立了CASVIT (CRISPR-assisted single viral genome tracking) 技术，其基于CRISPR-Tag的设计思路，在活细胞内可视化病毒基因组，实时捕捉宿主细胞内病毒复制的时空信息。双色CASVIT记录了单个病毒基因组DNA在独立的空间里（复制小室）进行大量的子代DNA复制的动态过程，发现复制小室的区域性高度稳定，趋于与其他复制小室相互接触但并不融合的特征。该方法还同时了追踪病毒的复制进程以及在相应阶段宿主染色质的变化，发现在病毒复制的早期阶段，宿主细胞发生了端粒和着丝粒DNA的显著重塑。CASVIT技术为研究病毒复制和病毒-宿主相互作用提供了重要的活细胞成像方法。
陈宝惠研究员博士后研究阶段在其导师黄波教授实验室(UCSF)与合作者利用CRISPR-Cas9系统开发了活细胞染色质成像的方法，之后为了解决非重复性DNA标记困难的挑战，提出了CRISPR-Tag的策略，在活细胞内实现了特异蛋白编码基因的DNA元件与蛋白的高效双标记，为解析基因表达调控奠定了重要的技术基础。CRISPR成像技术是利用核酸酶失活的Cas9（简称dCas9）与荧光蛋白 (fluorescent protein, 简称FP) 融合形成dCas9-FP，在sgRNA的引导下，在特定DNA位点上富集荧光信号，从而实现特定染色质区域的可视化。CRISPR-Tag是选择能被Cas9高效识别的DNA序列组装成形成的DNA标签，因而能被dCas9-FP高效标记并被可视化。
图1 CASVIT用于追踪病毒复制的基本原理
HSV-1的基因组DNA大小约为150 kb，以双链形式存在。该研究首先分别为来自于Streptococcus pyogenes和Staphylococcus aureus的Cas9系统设计了优化的CRISPR-Tag标签，大小均约为600 bp。通过细菌人工染色体(BAC)技术将CRISPR-Tag插入至HSV-1基因组的UL3与UL4之间的非编码区域，产生HSV-1CRISPR-Tag(Sp)和HSV-1CRISPR-Tag(Sa)两种重组病毒。病毒复制曲线显示CRISPR-Tag的整合并未显著影响病毒的复制能力。为了在宿主细胞内高效率地可视化这两种重组病毒DNA，该研究利用了串联的Split-GFP及SunTag系统进行荧光信号扩增，构建了dSpCas9-GFP14x和dSaCas9-tdTomato10x的双色CRISPR成像细胞株。重组病毒感染CRISPR成像细胞株(HeLa)后1-4个小时后可开始检测到病毒DNA出现在宿主细胞核内，之后病毒DNA进行大量复制，形成复制小室（Replication compartment, 简称RC）。通过CASVIT系统标记的病毒DNA也能被其结合蛋白ICP4标记。另外，利用ACV小分子抑制病毒复制的条件下，CASVIT检测不到RC形成。这两点说明CASVIT标记病毒DNA是高度特异的。
图2 三维双色CASVIT成像揭示RC互作但不融合的特征
CASVIT系统是首次能够采用双色的病毒DNA标记方法对HSV-1的病毒复制进行长时间追踪的方法。双色CASVIT实时成像系统清晰地监测到了单个病毒DNA在宿主细胞核内的独立空间里复制形成了大量子代DNA，并形成复制小室（RC），且RC的边界非常稳定。每个细胞核能形成约1-10个RC，RC之间常常发生互作。有意思的是不同的RC碰在一起并不发生融合，揭示了RC边界相当稳定的特征。DNA重组被认为是大多数生物进化的主要驱动力，因为它能加速生物体对环境的适应。RC的高稳定性使得病毒DNA之间或病毒DNA与人类基因组之间只能发生有限的重组事件，这可能部分解释了DNA病毒遗传物质相对稳定的特性。CASVIT的双色DNA标记系统还可用于同时监测病毒复制进程以及该过程中宿主染色质被重塑的动态变化。该研究发现从HSV-1复制早期开始，宿主细胞的着丝粒与端粒DNA开始发生显著的变化，揭示这些染色质区域可能被病毒重塑成利于其进行复制的分子基础。
图3 CASVIT实时成像监测病毒复制形成RC的动态过程
该研究采用新的病毒DNA标记方法监测病毒的复制过程，既证实或证伪了以往研究里的一些结论，也发现了以前采用固定细胞成像的方法无法捕捉到的动态信息。未来结合双色CASVIT和其他细胞亚结构的可视化，可进一步解析RC高度稳定、RC互作及宿主染色质重塑的分子机制和生物学意义。CASVIT技术操作方法相对简单，且CRISPR-Tag标签较小，对病毒基因影响小。与其他DNA标签（LacO/TetO和ANCHOR DNA）相比，使用CRISPR-Tag构建重组病毒的一个主要优点是可以设计大量多样化（不同种类与长度）的CRISPR-Tag来满足不同的要求。CRISPR-Tag设计的灵活性使其成为一类重要的的DNA标签。理论上，CASVIT技术可推广至其他DNA病毒的可视化研究。CASVIT还可运用于筛选抑制病毒复制的小分子的荧光报告系统。因此，CASVIT技术可成为基础研究和药物分子发现的重要工具。
图4 病毒DNA复制导致宿主染色质端粒与着丝粒的变化
浙江大学基础医学院博士生徐海月和硕士生王君岩、邓悦为本文的共同第一作者。博士后侯富军博士，博士生扶玉娟、陈思雨也参与了本研究。浙江大学基础医学院陈宝惠研究员、潘冬立研究员和转化医学研究院邹炜研究员为本文的共同通讯作者。本项目获得了国家科技部重点研发计划和国家自然科学基金的资助。