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冯友军课题组在乙酰化调控NAD代谢研究中取得进展

编辑: 严燕蓉 时间:2019年10月23日 访问次数:389

    浙江大学基础医学院病原生物与微生物学系冯友军课题组在NAD+代谢的稳态调控研究方面取得重要进展,以唯一通讯作者身份于10月9日在国际知名刊物eLife(5年IF:8) 在线发表题为“A single regulator NrtR controls bacterial NAD+homeostasis via its acetylation”的研究长文(https://elifesciences.org/articles/51603)。这是该课题组继去年发现乙酰化表观修饰参与调控生物素的代谢途径(Mol Microbiol, 2018)之后的又一力作。首次将乙酰化修饰与另一辅酶因子NAD+的代谢调控建立起了直接的联系。

    烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+是当前生物三域中一类不可或缺的辅因子,参与了包括能量代谢在内的多种生化反应。一般而言,生物体通过严密调节NAD+的de novo和salvage的代谢途径来维持NAD+水平的细胞稳态。NAD+代谢稳态的维系对于分枝杆菌在内的病原细菌完成其感染过程至关重要。因此,近年来NAD+代谢有望成为抗细菌感染的潜在药物靶点。

    NrtR是一种Nudix家族的转录调控因子,具有N末端Nudix样效应结构域和C末端wHTH DNA结合结构域。NrtR是一类保守的转录因子, 其同源蛋白广泛存在于多种微生物中。NrtR类调控蛋白在不同生物体中参与了一些重要代谢途径的调节,这包括NAD+代谢途径、戊糖的利用、ADP核糖基化的调节等。先前的研究业已表明海洋希瓦氏菌Shewanella NrtR参与调节NAD+的salvage途径。然而,该项研究发现了齿垢分支杆菌Mycobacterium smegmatis的NrtR蛋白(MSMEG_3198)仅调控NAD+的de novo从头生物合成途径(图1)。

 图1:NrtR参与NAD的代谢调控的机制模型

       通过凝胶阻滞迁移(EMSA)和表面等离子共振(SPR)等实验,定位了该NrtR调控功能依赖于位于nrtR/nadABC启动子之间的一段保守的DNA识别基序(TTTTCGATTATAAGTCGAAAAC)。包括LacZ报告系统在内的一系列体内实验结果显示NrtR不仅是一个自调控抑制子,而且负向调控nadABC操纵子的表达。基因敲除与遗传互补实验为NrtR控制胞内NAD+(NADH)浓度的提供了生理性证据。系统进化树分析与酶活力测试显示“该NrtR蛋白可能在进化过程中舍弃了其冗余的酶学功能”。该科学推断在该课题组新近对猪链球菌NrtR的研究中亦得到了佐证(FASEB J, 2019)。

     Westernblot与MALDI-TOF MS质谱分析揭示了该NrtR在134位赖氨酸残基(K134)处存在乙酰化修饰(图2)。

图2:NrtR(K134)乙酰化修饰的发现

    接下来的体内和体外实验证据夯实了该K134的乙酰化修饰对维系NrtR的转录调控功能是至关重要的。通常而言,乙酰化修饰方式包含2种形式:1) Pat/CobB酶促反应和2) 非酶促的AcP模式。为探明乙酰化的生理性来源,该研究通过构建一系列基因缺失突变体(除pat/cobB的敲除突变体外,亦灭活了AcP通路的ackA/pta基因)。进一步的体内与体外实验结果阐明了NrtR的乙酰化不是酶促催化所催化,而是依赖于以乙酰磷酸作为乙酰基团供体的非酶促AcP途径(图3)。

 

图3:NrtR(K134)乙酰化修饰依赖于非酶促反应的AcP通路

     

   最后,生理性实验亦表明AcP途径的功能性损伤可导致nadABC表达水平的变化进而影响胞内NAD+的积累水平(图4)。

 图4:AcP通路影响胞内NAD的累积水平

    该研究结果首次以细菌调控因子NrtR为纽带,将一类广泛的翻译后修饰形式----乙酰化修饰与重要的辅酶NAD+代谢过程建立起了直接联系,这为靶向NAD+途径的新抗感染靶点的深入挖掘和小分子药物筛选提供了理论基础。

     该研究工作得到了武汉病毒所邓教宇教授,浙江工业大学李俊博士以及美国StonyBrook University的BacharH Hassan博士的鼎立协助,2015级博士研究生高榕穗同学系该研究论文的第一作者。冯友军课题组主要聚焦于微生物代谢与致病/耐药机理的研究。通过整合“细菌遗传学、生物化学、结构生物学、化学生物学及生物信息学等”多学科手段,展开了大量有益的探索研究并陆续取得了阶段性成果。以第一作者/通讯作者身份,冯友军博士业已在PLoS  Pathogens、PLoS Genetics与eLife等重要学术刊物发表60余篇研究论文,论文累计引用6000余次(源自Google Scholar, H-index: 34)。2019年度,该研究团队亦受邀为国际著名期刊Trends in Biochemical Sciences (IF2019: 16.889) 撰写综述文章。该研究工作主要得到了国家自然科学基金重点项目(31830001)与科技部重点研发计划(2017YFD0500202)的联合资助。

供稿 | 冯友军课题组

编辑 | 王江勤