皮肤是机体的保护屏障，能防止机械损伤和外部病原体造成的损害。有效的伤口愈合以及保持表皮完整性的能力对于生物的生存至关重要。机械损伤通过相互关联的生化途径起作用，将物理线索转化为生物反应，并在调节各种生物体的组织修复和再生中发挥关键作用。在这些生物过程中产生的力依赖于肌动蛋白丝和肌球蛋白马达之间的相互作用。Rho家族GTPase酶CDC-42在动物体中中调控肌动蛋白聚合中起保守作用，并对线虫基于肌动蛋白的伤口愈合至关重要，然而关于组织如何感知机械损伤并调节肌动蛋白重塑知之甚少。对细胞或组织损伤的快速反应对于随后伤口愈合和机体存活至关重要。组织损伤会诱导 Ca2+ 和 H2O2 的不依赖转录的信号响应，从而促进伤口修复和炎症细胞迁移。但H2O2 调节如何快速调节的机制尚不完全清楚。
2021年11月23日，浙江大学基础医学院徐素宏课题组在Cell Reports杂志在线发表了题为“Redox-sensitive CDC-42 clustering promotes wound closure in C. elegans”的研究论文。研究表明H2O2调节 CDC-42 定位可以创建一个独特的生物分子簇，促进损伤后上皮细胞伤口的快速修复。
首先，利用CRISPR-Cas9系统构建转基因线虫，用荧光标记线虫内源性CDC-42蛋白，针刺损伤和激光损伤后在共聚焦显微镜下观察CDC-42蛋白的变化，发现损伤后CDC-42能够在伤口周围以点状形式发生聚集。
鉴于损伤使CDC-42在伤口周围发生局部聚集性，作者接下来继续研究CDC-42聚集性是否在肌动蛋白聚合的伤口愈合中发挥作用。发现损伤诱导的CDC-42聚集招募WSP-1以促进肌动蛋白聚合的伤口愈合。
接下来，为了确定损伤如何在短的时间内诱导CDC-42聚集，作者检测了早期创伤反应信号H2O2，损伤后最初会引起H2O2短暂地爆发性升高，随后下降并低至正常水平，并且损伤诱导的H2O2瞬间爆发依赖于双氧化酶。
为了研究H2O2是否会影响损伤后CDC-42聚集，作者构建了与H2O2合成及分解相关的突变体线虫，发现低浓度的H2O2促进CDC-42聚集，而高浓度的H2O2抑制CDC-42聚集，此外低浓度的H2O2也会促进肌动蛋白依赖性的伤口愈合速率。
继而，为了确定损伤是如何诱导CDC-42聚集的，作者研究了该过程是否需要膜附着，因为CDC-42聚集物与膜存在共定位。通过遗传学手段进行实验验证最终发现，异戊二烯化介导的 CDC-42 膜附着是聚集形成所必需的，并且CDC-42 C端多元区域可促进CAAX结构域介导的膜附着和聚集。
最后，试图确定H2O2如何负性调节损伤后CDC-42聚集反应。由于半胱氨酸残基作为细胞氧化还原状态的检测器，这种氨基酸与ROS反应形成二硫键，因此作者突变了CDC-42中所有半胱氨酸残基，然后检查了损伤后聚集情况。两个半胱氨酸突变—Cys18A和Cys105A，显示出CDC-42的数量和大小显著增加的表型，通过质谱、免疫印迹分析及遗传学手段，得出结论：CDC-42可能通过Cys18A和Cys105A这两个残基形成分子间二硫键，Cys18和Cys105是H2O2抑制CDC-42聚类所必需的，Cys18A和Cys105A突变导致未损伤状态下膜附着增加，导致损伤后CDC-42聚集增强。
综上所述，作者利用线虫表皮为模型，发现了损伤后CDC-42 快速重新定位到质膜上，随后招募 WSP-1 触发肌动蛋白聚合以愈合伤口。此外，伤口会导致H2O2局部瞬时爆发随后减少，这对 CDC-42 的聚集和伤口愈合起负向调节作用。CDC-42 CAAX 结构域介导的异戊二烯化和多元区域介导的阳离子-磷脂相互作用都是其聚集所必需的。半胱氨酸残基形成分子间二硫键以减少膜结合，并且是 H2O2对 CDC-42 聚集的负调节所必需的。
浙江大学基础医学院博士生许静秀，浙江大学爱丁堡大学联合学院/浙江大学附属第二医院博士后孟曦男为本文共同第一作者，浙江大学基础医学院，浙大爱丁堡大学联合学院，浙大附属浙二医院徐素宏教授为本文的通讯作者。该研究得到了清华大学欧光朔教授，浙江大学基础医学院孙启明，陈伟教授，浙江大学生命科学研究院马为锐教授和加州大学圣地亚哥分校Andrew Chisholm的大力支持。徐素宏实验室项目得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金委、浙江省自然科学基金等经费的支持。
实验室简介
徐素宏教授实验室主要从事皮肤损伤修复和再生、瘢痕形成的分子机制研究。
实验室近期招聘博士后1-2名，有从事小鼠皮肤研究和蛋白表达纯化的背景者优先。有意者请发送邮件至shxu@zju.edu.cn。
图文 | 许静秀
编辑 | 郭静娴
